细胞继代培养

前言：
1. 细胞生长至高密度时，即须收集细胞，分殖至新的培养瓶中，其稀释比例依细胞种类而异。
2. 收集细胞方法可用trypsin-EDTA、cell scraper、离心处理等，处理方法依细胞种类而异。
3. Trypsin-EDTA为收集吸附型细胞常用之方法。 Trypsin为胰蛋白酵素，其作用为分解细胞与瓶壁之附着蛋白， EDTA为chelating agent，其作用为去除Ca2+、Mg2+等离子，trypsin与EDTA二者共同作用，可使附着之细胞自瓶壁脱落。除了trypsin-EDTA，亦可使用cell scraper（细胞刮勺）刮落细胞。
4. Trypsin-EDTA作用时间勿太久，否则可能对细胞造成伤害或死亡。敲拍培养瓶不可太过猛烈，避免对细胞造成伤害或造成培养瓶裂痕而污染。
材料：
1. Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free
2. trypsin-EDTA solution （0.05% trypsin-0.53mM EDTA.4Na）：若为大体积包装，建议将其以少量分装于无菌试管中，保存于-20°C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。使用前放在37°C水槽中回温。
3. 新鲜培养基
4. 无菌吸管/离心管/培养瓶。
步骤：
1. 附着型细胞（adherent cell）
  1. 吸掉旧培养液。
  2. 用Dulbecco's phosphate-buffered saline洗涤细胞一至二次。
  3. 加入trypsin-EDTA溶液（1ml/T-25 flask， 2ml/T-75 flask）：
    1. 方法一：37°C或室温作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液，轻敲培养瓶边缘使细胞自瓶壁脱落，然后加入适量之新鲜培养基，与脱落之细胞或细胞团块混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，依正常条件继续培养之。
    2. 方法二：37°C或室温作用数分钟，待细胞自瓶壁脱落后，加入适量含血清之新鲜培养基，以终止trypsin作用（因血清中含有trypsin inhibitor，可以终止trypsin作用），离心后去除上清液，或不作离心处理，添加新鲜培养基后依稀释比例转移至新的培养瓶中，依正常条件继续培养之。
2. 悬浮型细胞（suspension cell）
  1. 吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm、 5分钟。
  2. 吸除上清液，加入适量之新鲜培养基，与沉淀细胞（cell pellet）混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，依正常条件继续培养。
3. 融合瘤（hybridoma）
  1. 有些hybridoma cell需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。

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标签：细胞培养废液抽吸 Biovac240

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