一文搞懂细胞凋亡检测：Annexin V/PI、JC-1、Caspase-3活性、TUNEL、PARP、Sub-G1 等从原理到多参数实操

细胞凋亡（Apoptosis）是一种程序性细胞死亡 (PCD)，其特征包括细胞皱缩、染色质凝聚、膜起泡和核碎裂。它对于形成和维持健康组织至关重要，几乎所有生物体在早期胚胎发育过程中都依靠细胞凋亡来清除多余细胞。它也是维持组织稳态的关键环节，通过清除衰老或受损细胞来平衡细胞群体的增殖与死亡。

很多人在做凋亡实验时，*常问的坑就是：“Annexin V 阳性了，但 Caspase-3 没激活？”“JC-1 红绿比下降了，是凋亡还是坏死？”“Sub-G1 峰怎么算比例？”今天这篇文章从凋亡原理入手，系统梳理主流检测方法：Annexin V/PI、JC-1、Caspase-3/7活性、7-AAD、TUNEL、PARP裂解、Sub-G1、Cytochrome c 释放等。重点讲解原理、实验步骤、数据解读和多参数组合（流式为主，但也包括 WB、IF、显微镜等）。读完后，你能全面掌握凋亡实验的设计与验证，避免假阳性/假阴性。

核心提醒：凋亡分阶段
早期：磷脂酰丝氨酸（PS）外翻、ΔΨm 下降、Caspase 激活
中期：DNA 片段化、细胞收缩
晚期：膜破裂、坏死样特征
凋亡 vs. 坏死 vs. 焦亡：需多标志物区分（Annexin V+ PI- = 早期凋亡；Annexin V+ PI+ = 晚期凋亡/坏死）。

一、细胞凋亡生物学基础

凋亡分两条主要通路：

• 外源性（死亡受体通路）

Fas/TNF-α 等配体 → 死亡诱导信号复合物（DISC） → Caspase-8 → Caspase-3/7 执行。

• 内源性（线粒体通路）

应激 → Bcl-2 家族调控 → 线粒体外膜通透（MOMP） → Cytochrome c 释放 → Apaf-1/Caspase-9 → Caspase-3/7。

关键事件：PS 外翻、ΔΨm 下降、Caspase 级联激活、DNA 断裂（180-200 bp 多聚体）、细胞收缩、凋亡小体形成。

二、主流检测方法原理与优缺点

1. Annexin V/PI 双染（流式金标准）

原理：Annexin V 结合外翻的 PS（Ca²⁺ 依赖），FITC/APC 标记；PI 进入膜破裂细胞。早期凋亡：Annexin V+ PI-；晚期：Annexin V+ PI+；坏死：Annexin V- PI+。

优点：活细胞兼容、早期检测；缺点：需 Ca²⁺ 缓冲液，背景需对照。

2. JC-1 检测线粒体膜电位下降

原理：JC-1 在高 ΔΨm 聚合红光，低 ΔΨm 单体绿光。凋亡早期 ΔΨm 崩解 → 红/绿比下降。

优点：内源通路早期标志；缺点：非特异（其他损伤也可降 ΔΨm），需 CCCP 阳性对照。

3. Caspase-3/7 活性检测

AMC）或抗体检测激活 Caspase-3/7。流式用荧光偶联底物或抗活性 Caspase-3 抗体。

优点：执行阶段特异；缺点：需裂解或固定，活细胞探针（如 CellEvent）更好。

4. 7-AAD 或 PI 单染（晚期凋亡/坏死）

7-AAD 类似 PI，但更特异进入膜破裂细胞。常与 Annexin V 组合，区分晚期凋亡（Annexin V+ 7-AAD+）与坏死。

5. TUNEL 检测（DNA 断裂）

原理：TdT 酶在 DNA 3'-OH 末端标记荧光 dUTP。标记断裂 DNA 末端。

优点：特异 DNA 片段化；缺点：晚期标志，固定后操作。

6. PARP 裂解（WB）

原理：Caspase-3 切割 PARP（116 kDa → 89 kDa 片段）。WB 检测裂解片段比例。

优点：下游执行证据；缺点：群体平均，无法区分亚群。

7. Sub-G1 峰（PI 染色中的凋亡碎片）

原理：凋亡细胞 DNA 寡核小体间断裂 → 小片段泄漏 → PI 荧光 <2N（Sub-G1 峰）。

优点：简单；缺点：非特异（坏死也可），需结合 Annexin V 验证。

8. Cytochrome c 释放（IF / WB）

胞质 → IF 胞质弥散（非点状线粒体），或分离线粒体/胞质组分 WB。

三、典型实验操作流程

方案1：Annexin V/PI 流式双染

1. 细胞处理后，温和消化（胰酶-EDTA 短时间）或直接收集悬浮细胞，4°C PBS 洗 2 次。
2. 用 1× Annexin V Binding Buffer 重悬至 1×10⁶ cells/mL。
3. 加 FITC-Annexin V（5 μL/100 μL 细胞悬液）+ PI（或 7-AAD，1–5 μg/mL），室温避光孵育 15–20 min。
4. 补加 400 μL Binding Buffer，1 h 内上机（FL1: Annexin V ~530 nm；FL3: PI/7-AAD ~650 nm）。
5. 门控：FSC/SSC 排除碎片和双联体；设单染对照补偿串色。
6. 阳性对照：H₂O₂ 或 staurosporine 处理；阴性对照：不加 Annexin V 或无 Ca²⁺ 缓冲液。

方案2：JC-1 染色（线粒体膜电位检测）

1. 细胞重悬于预热培养基或 PBS，浓度 1×10⁶ cells/mL。
2. 加 JC-1 工作液（2–5 μg/mL 或 10 μM，根据试剂盒推荐），37°C 避光孵育 15–30 min。
3. 4°C PBS 洗 2 次（去除未结合 JC-1，避免背景），重悬于 PBS 或 Binding Buffer。
4. 流式上机：488 nm 激发，FL1 通道（绿色单体 ~530/30 nm），FL2/FL3 通道（红色聚合物 ~585/42 或 610/20 nm）。也可荧光显微镜拍照。
5. 阳性对照：CCCP（10–50 μM）处理 15–30 min 诱导完全去极化；阴性对照：未处理健康细胞。
6. 数据分析：计算红/绿 MFI 比值（或圈出“绿色高”亚群比例作为去极化细胞%）；建议用 FlowJo 做红 vs. 绿双参数图。

方案3：Caspase 活性流式检测

1. 推荐活细胞探针（如 Cell Meter™检测试剂盒）：按试剂盒说明，1×10⁶ cells/mL 加入 1–2× 工作浓度探针，37°C 避光孵育 1–4小时（期间可轻摇）。
2. 可选双染：孵育结束后加DNA 染料（例如Green-DCS 用于死细胞）标记细胞，继续室温 5–10 min。
3. 上机：FL3 通道（APC Caspase 活性 ~561 nm），FL1 通道（FITC通道 ~488 nm）。
4. 阳性对照：staurosporine（1 μM，4–6 h）或 camptothecin 处理；阴性对照：未处理细胞 + Z-VAD-FMK（广谱 Caspase 抑制剂）预处理。
5. 数据分析：Caspase+ 细胞比例，或 Caspase MFI 比较。

方案4：TUNEL IF（免疫荧光检测 DNA 断裂）

1. 细胞接种于盖玻片或腔室玻片，处理后用 4% 多聚甲醛（PFA）室温固定 15–30 min。
2. PBS 洗 3 次，0.1–0.2% Triton X-100 通透 10 min（或用 0.1% 柠檬酸钠 + 0.1% Triton 通透）。
3. PBS 洗 3 次，加 TdT 平衡缓冲液（Equilibration Buffer）室温 10 min。
4. 配制 TUNEL 反应液：TdT 酶 + 荧光 dUTP（如 FITC-dUTP 或 Alexa Fluor 488-dUTP），37°C 避光孵育 60 min（湿度盒内）。
5. PBS 洗 3 次，DAPI 或 Hoechst 33342 复染核 5 min。
6. PBS 洗，抗荧光淬灭封片液封片，共聚焦或荧光显微镜观察（488 nm 激发绿，405 nm 激发蓝核）。
7. 阳性对照：DNase I 处理（产生人工断裂末端）；阴性对照：不加 TdT 酶。
8. 解读：凋亡细胞核呈明亮绿色点状/弥散荧光（TUNEL+），常伴核浓缩/碎裂；统计 TUNEL+ 细胞比例或每视野 TUNEL+ 核数。

方案5：PARP 裂解 Western Blot

1. 细胞处理后，冰上用 RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制剂 cocktail + 1 mM PMSF）裂解 30 min，每 10 min 涡旋一次。
2. 4°C 12,000 g 离心 15 min，取上清，BCA 法蛋白定量（建议 20–40 μg/泳道）。
3. SDS-PAGE（10% 分离胶），转 PVDF 膜，5% 脱脂奶粉封闭 1 h。
4. 一抗：anti-PARP 抗体（1:1000，通常识别全长 116 kDa 和裂解 89 kDa 片段），4°C 过夜。
5. TBST 洗 3 次，二抗（HRP 标记，1:5000）室温 1 h，TBST 洗 3 次。
6. ECL 或超敏 ECL 显影，ImageJ 定量裂解比例：裂解片段% = 89 kDa 灰度 / (116 kDa + 89 kDa) 灰度 × *。
7. 内参：β-actin 或 GAPDH；阳性对照：staurosporine 处理组裂解片段明显增加。

四、数据解读与常见问题

• Annexin V/PI 四象限
  Q1 (Annexin- PI+) 坏死；Q2 (Annexin+ PI+) 晚凋亡；Q3 (Annexin+ PI-) 早期凋亡；Q4 活细胞。
• JC-1
  红/绿比下降 >30% → 早期凋亡。
• Caspase-3
  活性升高 + Annexin V+ → 确认凋亡通路。
• Sub-G1
  比例 >5-10% → 凋亡增加，但需结合其他标志。
• 常见坑
  Annexin V 背景高 → 加 EDTA 对照；JC-1 毒性 → 浓度优化；多参数补偿串色 → 单染管校准。

细胞凋亡检测是多标志物验证的过程，单一方法容易误判。希望这篇全面指南帮你设计出可靠实验，有任何具体问题欢迎留言讨论～

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