细胞培养废液抽吸

内容大纲
细胞培养与废液抽吸
细胞培养继代流程
废液抽吸方法的比较
细胞培养的实验室基础设备
废液处理与废弃办法

什么是废液抽吸？

废液抽吸 （aspiration / suction） 是现代生物学技术中常用的技术，用以移除细胞培养等实验作的废弃液体。

生物学中常见的细胞培养，是将真核或原核细胞培养于适宜的培养液 （culture medium） 环境中，使其在受控制的状态下生长 （growth） 及增殖 （proliferation）的过程。 细胞培养的流程包含解冻细胞、培养 （cell culture）、继代培养 （俗称分盘，cell subculture） 及冷冻细胞等步骤。

而在细胞生长过程中会产生代谢物、细胞碎片等废弃物影响细胞健康，甚至导致细胞凋亡。 因此在细胞培养过程中，需定期更换培养液，而移除旧有培养液、洗涤液的行为，则为废液抽吸。

真空废液抽吸装置 （suction system， aspiration system） 常见如上图，主要包含：

1. 真空瓶 （vacuum flask）
2. 缓冲瓶 （safety bottle）
3. 过滤器（filter）
4. 真空源 （vacuum source）：如真空泵。

连接并启动真空泵后，细胞培养瓶/皿中的废液会因压力差而被抽吸、收集至真空瓶，缓冲瓶则做为防溢装置使用，以避免废液被抽吸至真空源内。 过滤器可使用HEPA滤膜（High Efficiency Particulate Air filter 或 0.22 μm过滤器，以过滤掉废液及空气中的粒子、确保抽吸的效率。

细胞培养继代流程

▲ 细胞培养前，请确认作环境符合无菌作条件，且应避免和细菌实验共享设备，以防污染。

1. 解冻细胞 （thawing cells）：将冷冻细胞以 37 oC 快速解冻、回温，以避免细胞损伤。
2. 培养 （cell culture）：依据细胞种类和浓度，将细胞和培养基均匀混合后，放入培养箱中培养。
3. 继代培养 （cell subculture）：当细胞生长至一定程度后，收集细胞，分殖于新的培养基中。
   进行继代培养时，其依细胞种类不同，处理方式可分为以下两大类：

   a. 附着型细胞 （adherent cell），又称贴壁培养、单层培养 （monolayer culture）
   

   1. 去除旧培养基废液
   2. 以 Phosphate buffered saline （PBS） 洗涤细胞一至二次
   3. 加入 trypsin-EDTA溶液，于 37 oC 下作用 2~20 分钟，使细胞可自培养瓶/皿中脱落
   4. 加入含有血清的新鲜培养基中，以终止胰蛋白酶作用
   5. 将脱落的细胞及其团块打散、混合均匀后，收集所有液体
   6. 离心后移除上清液，并添加新鲜培养基，依稀释比例转移至新的培养瓶/皿中进行培养

   b. 悬浮型细胞 （suspension cell），又称悬浮培养 （suspension culture）

   1. 将细胞培养液以 1000 rpm 离心 5 分钟后，吸除上清液
   2. 加入适量新鲜培养基，与沉淀细胞混合均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶/皿中进行培养。
4. 冷冻细胞 （cryopreservation）：获得目标细胞株后，将细胞悬浮于含有 5~10 % DMSO （二甲基亚砜，dimethyl sulfoxide） 及 30~50% FBS （胎牛血清，Fetal Bovine Serum） 的新鲜培养液中，以 -80 oC 或液态氮等低温设备保存。
5. 细胞计数 （cell counting）：用以计算细胞浓度，可利用传统血球计数器 （Neubauer chamber） 或自动计数器 ，计算细胞浓度可用来判断目前细胞生长的情况。

废液抽吸方法的比较

废液抽吸目前有多种方法可以进行。 早期实验室多利用移液器（pipette）或电动吸管抽吸废液，然而因为需要重复抽吸及排除液体，长时间使用下来易造成手部不适及疲劳。 除此之外，电动吸管须搭配无菌刻度吸管使用，而现多使用抛弃式吸管排除污染疑虑，因此一次实验下来通常会产生大量废弃物，造成环境负担。
现代实验室则普遍会自行购置真空泵搭配真空瓶自行组装，如此会较电动吸管有效率，且设备取得较容易，然而自组式系统常见许多例如：管线配置不良，造成工作环境混乱、或是玻璃吸管经常破裂等安全性上的缺点。

Lafil 废液抽吸系统及 BioDolphin 废液抽吸套件主要为生命科学细胞培养或实验过程中溶液抽吸应用，可直接放置于无菌无尘作台 （laminar flow） 使用。 Lafil 废液抽吸系统整合真空源、真空瓶与废液抽吸套件，提供实验室一体化解决方案，更比传统废液抽吸系统减少一半台面占用面积，并使用围篱式平台固定真空瓶，避免作者不小心碰触瓶身而倾倒。
洛科Lafil 废液抽吸系统及 BioDolphin 废液抽吸套件

细胞培养实验室基础设备

废液处理与废弃办法

含有危险化学品（如氯）之有机废液应收集至设有适当标示之专用废液桶，不含危险化学品之其它废液可一并收集于一般混合废液桶，废油则需收集于废油桶中。 细胞培养用的废液应加入适当浓度的消毒剂，如漂白水（次氯酸钠Sodium Hypochlorite），使细胞致死，再倒入水槽或废液桶。 培养皿等生物医疗相关废弃物则应置于生物医疗废弃物袋中，进行高温高压灭菌后以一般废弃物丢弃，或是请依照我国生物医疗废弃物相关规定处理。

参考资料

• Cell Culture Basics: Equipment, Fundamentals and Protocols | Technology Networks
• Cell Culture Basics, EU (vanderbilt.edu)
• Cell Culture Fundamentals: Safety Aspects of Cell Culture, Sigma-Aldrich
• Cell culture protocol, Proteintech
• Cell culture | 细胞培养，ACE Biolabs
• Laboratory Environmental Sample Disposal Information Document, Section 6.0, 2010, US EPA
• TISSUE CULTURE WASTE DISPOSAL GUIDELINES, 2017, Laboratory Safety, THE GEORGE WASHINGTON UNIVERSITY
• Tissue Culture Waste Disposal Guide, 2022, EHS, Weill Cornell Medicine
• 行政院环境保护署，事业废弃物贮存清除处理方法及设施标准，环署循字第 1111016706号
• 细胞继代培养，生物资源保存及研究中心-BCRC小教室