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胞外囊泡 （Extracellular Vesicles， EVs） 因其具有作为生物标志 （biomarker） 和*工具 （therapeutic tools） 的巨大潜力而在生物学和医学领域日益受到关注。 然而，EVs 的异质性 （heterogeneity） 和复杂性也为新手带来许多挑战。
深入技术细节及详情，请见专文：
• 从探索到验证：为何需要“外泌体标准品”？
• 如何使用切向流过滤纯化外泌体？
胞外囊泡 （Extracellular Vesicles， EVs） 是指从细胞释放、由脂双层膜包裹 （delimited by a lipid bilayer） 且无自我复制能力 （replicate） 的颗粒。 在早期研究中，将 EVs 依其生物起源 （biogenesis） 和尺寸 （size） 主要分为3大类：
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外泌体 (Exosomes) |
微囊泡 (Microvesicles) |
凋亡小体 (Apoptotic bodies) | |
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尺寸 |
40 ~ 120 nm |
100 ~ 1000 nm |
1000 ~ 5000 nm |
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生物起源 |
多囊体（MVB），透过内吞途径 |
细胞膜，透过向外出芽 |
细胞膜，细胞凋亡过程 |
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标志& 组成 |
Tetraspanin (CD9, CD63, CD81), Alix, Tsg101, flotillin-1 |
Selectins, Integrins |
DNA, histones, cell organelles, Nuclear fractions, Annexin V. |
然而，国际胞外囊泡学会（ISEV）在MISEV2018及MISEV2023建议：若无明确的生物起源证据，优先采用作性命名，可依囊泡的物理特征、表面标志、细胞状况或形态进行命名，如 sEV （小EVs）、lEV （大EVs） 及 CD63+ EV 等通用术语。
外泌体 （exosomes） 指源于胞内体系统 （endosomal system） 且经多囊体 （MVB） 释放的 EVs; 惟在实务上难以直接证明起源，故在缺乏证据时不建议泛用此术语。 其常见报导尺寸约介于 40 ~ 120 nm间，常见标志为四跨膜蛋白 （tetraspanins），如 CD9、CD63、CD81 等。 外泌体可携带其亲代细胞 （parent cell） 的核酸 （DNA、RNA）、脂质和蛋白质等分子讯息，并传递至受体细胞 （recipient cell） 调控其功能，影响多种生理功能及疾病进程，具强大的*潜力，故成为近年研究热点。
EVs 研究涉及多个关键步骤，包含样品准备到*后的分析和储存各步骤都会影响EVs的品质。
目的：获取含有 EVs 的原始生物材料，并尽早移除细胞及特定污染物。
材料：EVs 可从生物源获取，如细胞培养液 （cell culture-conditioned medium）、细菌 （bacteria）、血液 （blood）、尿液 （urine） 、牛奶 （milk） 等。
通用建议：
请报告样品来源、数量（如体积、重量）及采集的方法及储存的所有细节。
• 从原始材料中尽早移除细胞，否则细胞破损可能形成类天然 EVs 的颗粒; 细胞死亡及活化也可能会改变 EVs 的组成和功能。
• 建议在样本储存之前先完成必要的前处理，以去除可能的干扰物质，如细胞。
• 样品储存可能对 EVs 产生影响，请避免反复冻融循环 （freeze‐thaw cycles）。
• 报告 EVs 分离前后的所有储存条件，含防腐剂 （preservatives） 或冷冻剂 （cryoprotectants）、温度、时间、冷冻程序、储存容器、冻融循环次数和解冻方法。
* 本文仅列通用建议，针对各类样品之个别建议，请查阅 MISEV2023
目的：从原始生物材料中分离 EVs、提高 EVs 浓度，同时尽可能减少非 EVs 成分 （如游离蛋白、脂蛋白、细胞碎片等） 的干扰。
纯化方法：每种方法的回收率 （recovery） 及特异性 （specificity） 皆有所不同，应依据样品的特性选择不同的分离 （isolation） 或富集 （enrichment）方法，如差速离心法 （dUC）、密度梯度离心法 （DG， dgUC）、 超过滤法 （UF）、粒径筛析层析法 （SEC）、沈淀法 （ precipitation） 等。
通用建议：
依据 EVs 的来源特性、研究目的以及所需的 EVs 产率和特异性来决定分离方法。
• 需要更高纯度的 EVs 时，可考虑串联两种以上不同原理的纯化方法
• 大体积材料来源可能需要先浓缩再分离会更有效率，如 CCM、尿液、牛奶。
• 针对市售商业套组，应优先选择公开分离原理及成分细节的套组。
• 所有 EV 分离方法皆建议提供纯度与回收率佐证。
• 提供足够的方法细节以利重现每个分离和浓缩步骤。
• 评估或建议新分离/浓缩方法时，请在每个步骤前/后对 EVs 进行测试，以估算其富集倍数 （fold enrichment） 及产量 （yield）。
延伸阅读：如何使用切向流过滤纯化外泌体？
目的：确认分离的颗粒是否为 EVs，可对其大小、浓度、形态和生物标志物进行分析，是验证分离可靠性的关键步骤。
定量及表征方法：EVs 表征方法包含颗粒浓度、蛋白质含量、脂质含量、总 RNA 含量、EVs 形态、蛋白质组成等。
通用建议：
• EVs 表征应至少包含三个层面的信息：
（1） 特理与定量特性 （如颗粒浓度、粒径分布），用以描述样品的整体性质;
（2） EVs 标志物 （如跨膜蛋白、GPI 锚定蛋白、胞质或细胞膜来源蛋白），以确认样品为 EVs;
（3） 非 EV 共分离成份 （non-EV proteins），用以评估样品纯度并区分非 EV 来源的污染物。
• 没有单一的测量方法能够满足所有表征要求，建议使用检测极限不同的正交法 （orthogonal methods） 进行测量。
• 报告所有分析方法的细节，包括仪器、参数和数据分析过程，以确保实验的可重复性和透明度。
• 建议以生物源定义 EVs 的产量，如细胞的数量、生物体液体积、组织重量等。
• 应进行 EVs 的定量计算，如颗粒数量、蛋白质 （protein） 和/或脂质 （lipid） 含量。
• 应对 EVs 的通用成份或特定成份进行测试，尤其有特异性要求时，如 EVs 亚型 （EV subtypes）。
• 应根据希望达到的特异性对EV制剂进行测试，以确定是否存在与EV亚型或EV相关的成分。
• 需确定非囊泡 （non-vesicular）、共分离 （co-isolated） 成分的存在程度。
• 使用定量指标来表征 EVs 时，提供仪器及方法检测极限 （LOD）。
•鼓励使用标准品、阴性对照与多重检测平台交叉验证
延伸阅读：从探索到验证：为何需要“外泌体标准品”？
目的：维持已分离 EVs 的完整性、功能和稳定性，以供后续实验使用。 不当的储存会影响 EVs 的特性 （characteristics），包括稳定性 （stability）、颗粒数量、聚集 （aggregation） 和功能 （function）。
通用建议：
报告 EVs 分离前后的所有储存条件，含防腐剂 （preservatives） 或冷冻剂 （cryoprotectants）、温度、时间、冷冻程序、储存容器、冻融循环次数和解冻方法。
• 避免反复冻融循环 （freeze-thaw cycles），建议可分装 （aliquoting） 使用。
• 建议快速冷冻及解冻样品，以利*限度地保留 EVs 的形态和功能。
EVs 的复杂性常常让新手陷入一些常见的陷阱
命名混淆
样品污染：细胞培养的血清或补充剂常含有大量外源性 EVs 及其它因子。 进行 EVs 相关实验时，务必去除内含 EVs 或直接使用无血清培养液，减少 EV 污染的可能性。
细胞干扰：搜集样品后未能及时且彻底地移除细胞，死细胞或受损细胞则可能形成类天然 EVs 的颗粒、释出胞内成份、改变 EVs 组成及功能，造成结果失真。
分离方法选择不当：不同的分离方法有不同的回收率和纯度及其优缺点。 应根据样品类型、实验目的及后续应用，选择能够提供足够纯度和回收率的纯化方法。
表征不足：未充份表征或未检测常见污染物 （如脂蛋白lipoprotein），不足以确认检测物为 EVs 或导致实验结论不可靠。 建议采用多种方法进行全面的表征。
储存不当：反复冻融、温度或储存容器都可能导致 EVs 的完整性、浓度和功能受损。 务必严格遵循标准储存流程并详实记录。
