真空纯化系统在质粒提取中的应用

质粒提取是分子生物学中的常规操作，通常分为以下主要步骤（以碱裂解法为例）：

1. 细菌培养与收集

培养：将含质粒的细菌（如大肠杆菌）在选择性培养基（如含抗生素的LB培养基）中培养至对数生长期（OD₅₀₀ ≈ 0.6-0.8）。

收集：离心收集菌体（如12,000 rpm, 1分钟），弃上清。

2. 菌体裂解

• 重悬：用缓冲液（如Solution I/悬浮缓冲液，含RNase）重悬菌体，打散沉淀。
• 裂解：加入碱裂解液（如Solution II，含NaOH和SDS），使细胞膜破裂，释放质粒和基因组DNA（此时溶液变黏稠透明）。
• 中和：加入中和缓冲液（如Solution III，含醋酸或高盐），使DNA复性；质粒因结构小而迅速复性，而基因组DNA形成沉淀。

3. 去除杂质

离心：高速离心（如12,000 rpm, 10分钟），去除细胞碎片、基因组DNA和蛋白质沉淀，上清含质粒。

4. 质粒纯化

柱纯化法（常用）：

•   - 上清通过硅胶膜吸附柱，质粒DNA在离液盐（如高浓度NaCl或盐酸胍）条件下结合至膜上。
•   - 用洗涤液（如乙醇缓冲液）去除残留杂质。
•   - 用无核酸酶水或TE缓冲液洗脱质粒。

酚氯仿抽提法（传统方法）：

   用酚/氯仿抽提去除蛋白质，乙醇沉淀质粒DNA。

5. 质粒检测

• 浓度检测：Nanodrop或Qubit测定浓度和纯度（A₂₆₀/A₂₈₀比值应接近1.8）。
• 电泳验证：琼脂糖凝胶电泳观察条带（质粒可能出现超螺旋、线性和开环三种形态）。
• 酶切验证（可选）：用限制性内切酶切割后电泳，确认质粒大小和结构。

注意事项

• 防止降解：操作避免剧烈震荡（尤其裂解后），减少剪切力。
• 去除RNA：确保缓冲液含RNase，避免RNA污染。
• 内毒素去除（转染实验需注意）：可用特殊试剂盒或额外洗涤步骤。

不同试剂盒（如Qiagen、TIANGEN等）步骤可能略有差异，但核心原理相同。如需具体protocol，可根据实验需求选择相应试剂盒或优化方法。

真空纯化系统在质粒提取中的应用

真空纯化系统（Vacuum-based Purification System）是一种高效、高通量的核酸纯化技术，广泛应用于质粒DNA提取过程中，尤其适合中到大规模样本处理（如96孔板形式）。其核心原理是通过负压驱动溶液通过吸附膜（如硅胶膜），实现质粒DNA的快速结合、洗涤和洗脱。

1. 真空纯化系统的工作原理

1.  结合：裂解后的样本（含质粒DNA）在离液盐（如盐酸胍或高盐缓冲液）存在下，通过负压吸附至硅胶膜上，与杂质（蛋白质、基因组DNA、细胞碎片等）分离。  
2. 洗涤：在真空作用下，洗涤液（通常含乙醇）快速通过膜，去除残留的盐、代谢物和内毒素。  
3. 洗脱：*后用无核酸酶水或低盐缓冲液洗脱纯化的质粒DNA。

2. 在质粒提取中的具体应用步骤

以常见的真空纯化试剂盒（如QIAGEN Plasmid Vacuum Kit）为例：  

1. 细菌裂解：  

   - 碱裂解法裂解细菌（Solution I/II/III处理）。  

2. 上样至真空板：  

   - 将裂解液上清转移至多孔真空纯化板（如96孔板），板底部含硅胶膜。  

3. 真空抽滤：  

   - 连接真空泵，负压使液体快速通过膜，质粒DNA被捕获，杂质被滤除。  

4. 洗涤：  

   - 加入洗涤缓冲液，真空抽干去除残留污染物。  

5. 洗脱：  

   - 加入洗脱缓冲液（如TE或水），关闭真空，静置1-2分钟使DNA溶解，*后收集洗脱液。

3. 优势

高通量：可同时处理多个样本（如96孔板），适合大规模质粒制备。  

快速：比传统离心柱法节省时间（如30分钟内完成96个样本）。  

自动化兼容：可与液体处理工作站联用，减少人工操作。  

高纯度：有效去除内毒素、宿主DNA和RNA，适合转染、测序等敏感实验。  

4. 局限性

设备依赖：需真空泵或多孔板真空装置。  

膜堵塞风险：若样本含过多杂质（如未彻底裂解的菌体），可能降低流速。  

成本较高：相比常规离心柱法，真空板成本更高，适合大批量样本。

5. 适用场景

高通量克隆筛选：如构建文库、突变体筛选。  

质粒中提/大提：需快速获得大量高纯度质粒（如病毒载体制备）。  

自动化平台：整合至机器人液体处理系统，用于工业化生产。  

## **6. 对比其他纯化方法**

| **方法**               | **通量**       | **速度**       | **纯度**       | **适用规模**          |

|------------------------|---------------|---------------|---------------|-----------------------|

| **真空纯化系统**       | 高（96孔板）  | 快（<30分钟） | 高（低内毒素）| 中到大样本量          |

| **离心柱法**           | 低（单管）    | 中等（1小时） | 高            | 小到中样本量          |

| **酚氯仿抽提法**       | 低            | 慢（2小时+）  | 中等          | 小样本，低成本需求    |

7. 注意事项

裂解液处理：确保裂解完全，避免堵塞膜孔。  

真空压力控制：压力过高可能导致膜破损，过低则降低效率。  

洗脱优化：适当延长洗脱时间或加热（65°C）可提高得率。  

真空纯化系统在质粒提取中极大提升了效率和一致性，尤其适合需要高通量、标准化操作的实验室。选择时需权衡成本、通量和设备条件。

注意：真空纯化只有前面洗脱的步骤能代替离心机，*后的回收还要用离心机衬管收集。如下图所示。