ELISA

内容大纲
什么是 ELISA？
作ELISA的四种方法
造成ELISA伪阳性、高背景值、无讯号的原因
ELISA的作流程
ELISA和PCR的差异是？

什么是 ELISA？

酵素链接免疫吸附法 （Enzyme-Linked Immunosorbent Assay， ELISA），又称酵素免疫分析 （enzyme immunoassay， EIA）、酶联法，是一种灵敏、特异且广泛应用于生物学、生化学和医学研究中的分子生物学分析技术。 其原理为在固体表面 （如微孔盘） 上，利用抗原及抗体间的专一性键结，以酵素标记的抗体或抗原，以检测样品中的目标分子。 而用以标记的酵素被称为报道酵素，常见的有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， AP）等。
ELISA 相较于其它的免疫分析技术具有更多优势。 首先，相较于其他免疫学检测技术，ELISA具有更高的灵敏度和专一性，可以检测非常低浓度的生物分子，如蛋白质、抗体和细胞因子等，并可区分相似的分子。 这使得ELISA在诊断疾病、监测病情、检测病原体等方面更加具有可信度和*度。
作上，ELISA作简单、快速、容易自动化，可减少人工作的误差，提高实验的稳定性和可重复性。 而且，ELISA所需的样品量很小，能够节省宝贵的样品。 ELISA 亦常应用于高通量 （high throughput） 检测，同时检测多种样品，有效提高检测效率、节省时间和成本。 同时，由于 ELISA 是一种非放射性的检测方法，不存在辐射危害，符合环保和人体健康的要求。 基于以上优势，ELISA 被广泛应用于临床诊断、生命科学研究等领域。

ELISA 依分析目的不同，可分为定性、定量及半定量生物分子

• 定性 （qualitative）：
  用于确定样品中是否存在特定的生物分子，例如病原体抗原、抗体等。 通常使用单一抗体对样品进行检测，如果样品中存在目标分子，就会产生信号; 反之，则不会产生信号。
• 定量（quantitative）：
  用于测量样品中目标分子的浓度，通常使用标准曲线法（standard curve）进行定量。 在分析时，样品的吸光值与标准曲线上的已知样品浓度相对应，就可以计算出样品中目标分子的浓度。
• 半定量 （semi-quantitative）：
  是一种介于定性和定量之间的分析方法，通常用于测量样品中目标分子的相对浓度。 其是将样品与已知浓度的标准物质进行比较，来估算样品中目标分子的相对浓度。

作ELISA的四种方法

依不同作方法，ELISA 又可分为直接法 （Direct ELISA）、间接法 （Indirect ELISA）、三明治法 （Sandwich ELISA）、竞争法 （Competitive ELISA） 四种方法。

直接法 （Direct ELISA）

直接法通常用于检测抗原，在过程中只需要使用到一种一级抗体 （primary antibody），不需要复杂的步骤即可侦测分析物 （analyte），为*简单的 ELISA 方法。 其作方法是将目标抗原固定（coating; immobilizing） 于固体表面 （solid phase） 上，一般使用 96 孔微孔盘 （96-well plate），再使用酵素标记之一级抗体检测待测抗原。 由于反应过程单纯，直接法可以快速分析结果，且不会产生二级抗体（secondary antibody）的非专一性交互反应。 然而，也因为只使用到一种抗体，直接法无法放大检测信号（signal amplification）、降低其侦测的灵敏度。 此外，试验中的一级抗体都必须用酵素标记，相当耗时、耗成本。

間接法 （Indirect ELISA）

间接法是一种使用一级抗体与酵素标记的二级抗体进行结合的检测方法，通常用于检测未知的一级抗体。 其中，*常见的应用实例是用于检测艾滋病毒 （human immunodeficiency virus， HIV）。
这个方法的步骤是先将已知抗原固定在固体表面上，加入检体，再加入酵素标记的二级抗体（secondary antibody），以侦测待测抗体。 由于使用了两种抗体，因此间接法具有较高的灵敏度，且可使用多种一级抗体，在应用上更具弹性。
然而，间接法中二级抗体间可能会发生交互作用，导致非专一性的信号产生，影响实验结果的准确性。 为了解决这个问题，可以在实验过程中加入阻断液（blocking solution），减少非专一性的交互作用。 如此一来，间接法就能够更准确地检测待测抗体，并得到可靠的结果。

三明治法 （Sandwich ELISA）

三明治法是利用两种抗体对检体中的待测抗原进行两次专一性辨认，因此具有高侦测灵敏度及高专一性。 家用验孕试纸即是三明治法的应用实例之一。 不过，此方法中的待测抗原须为多价抗原，以便与两种或以上的专一性抗体结合。 与直接法和间接法不同的是，三明治法是将捕捉抗体（capture antibody）固定在固体表面上，再加入检体，捕捉抗体会抓住检体中具有专一性的抗原，再与一级抗体及酵素标记二级抗体反应。 由于这个高度辨识的过程，检体不需要事先进行纯化，而可直接进行实验。 然而，需要注意的是，在使用此方法时必须选用特定的一级抗体及二级抗体。 为了避免一级抗体跟二级抗体竞争与抗原结合的现象发生，必须确认一级抗体跟二级抗体具有不同的抗原表位（epitopes，即抗原上可与抗体结合的位置），且必须验证一级抗体跟二级抗体可进行专一性结合，并可同时作用。

竞争法（ Competitive ELISA）

竞争法，又称为竞争抑制ELISA （inhibition ELISA），是利用待测抗原与酵素标记的生物分子，竞争结合于固定在固体表面上的抗原或抗体。 若待测抗原在检体中浓度越高，就会与越多抗体结合，导致有酵素标记之抗体结合少，呈色反应讯号值亦越低，即待测抗原浓度与呈色反应成反比。 一般多用于检测半抗原（hapten）或小分子抗原。

造成ELISA伪阳性、高背景值、无讯号的原因

ELISA常面临结果不稳定的状况，如伪阳性 （false positive）、高背景值 （high background）、无讯号或讯号太低 （no or low signal） 等。 而造成伪阳性或高背景值的原因，部份是由于未结合的抗体、抗原或是杂质在各步骤间没有被完全去除，从而导致背景信号或是非专一性的交互作用。

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ELISA的作流程

为了降低伪阳性及高背景值的可能性，ELISA各步骤间必须进行清洗（wash），借由此步骤去除非专一性或亲和力低的反应物干扰。 清洗液通常为磷酸盐PBS缓冲溶液或TBS缓冲液，并可添加适当浓度的界面活性剂，如0.01%~0.1% Tween-20或Triton X-100 以降低样品中的非专一性结合 。
清洗的过程非常重要。 一般而言，每个清洗步骤需以缓冲液清洗 2~5 次。 若使用人工手动清洗，则需注意甩净残留反应液，并且于甩净残液后，尽快加入下一个步骤的反应液，以避免微孔盘过度干燥，亦可运用工具例如微孔盘清洗机进行清洗，以加快清洗速度、避免交叉污染。

ELISA和PCR的差异是？

ELISA 及 PCR 都是分子生物学中常使用的分析技术，总的来说，两者皆有其优缺点，因此需要依据具体的应用选择要使用哪种技术。 以2019年造成全球疫情大流行的新冠肺炎（COVID-19）为例，ELISA及PCR都可以用来检测冠状病毒（coronavirus），但应用上仍有些许差异。

因此，在流行病学中，利用 ELISA 搭配 PCR 检测病毒或其它生物子，如猴痘病毒 （Monkeypox virus， MPV）、汉他病毒 （Hantavirus）、诺罗病毒 （Norovirus） 等，可以达到更全面的检测效果。
另一种技术，则是将 ELISA 与 PCR 结合，为 PCR-ELISA。 此方法可以将固定于固体表面的DNA，直接以PCR定量DNA产物。 由于本篇主要探讨 ELISA 之分析方法，本文将不针对 PCR-ELISA 进行讨论。

ELISA常见应用：

• 临床医学：癌症、自体免疫疾病、传染病等疾病的诊断
• 病毒检测：冠状病毒 （coronavirus， SARS-CoV-2）、艾滋病毒 （HIV）、西尼罗病毒 （West Nile Virus） 等
• 即时检测：家用验孕试剂
• 学术研究：DNA/RNA 定量、细胞信号传递、代谢途径、基因表达和调控等
• 食品安全：食品过敏原